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          水楊酸介導的表皮葡萄球菌生物膜抑制機制

          引言:凝固酶陰性葡萄球菌是與假肢相關的感染的重要原因,表皮葡萄球菌的許多分離物通過產生大量細胞外粘液從而很容易附著在這種裝置上。粘液被認為是重要的毒力因子,因為它可以形成有利于細菌持久性并最終促進感染的生物膜。

          水楊酸(SAL)抑制表皮葡萄球菌的粘附和生物膜的形成,有人認為其機制可能與陽離子的螯合有關。為了驗證這種假設,本研究在表皮葡萄球菌培養物中加入了各種濃度的二價陽離子和SAL,并評估了其對生物膜產生的影響。

          方法:選擇表皮葡萄球菌菌株:91,RP62A(ATCC35984)和M187sp11,這些菌株產生粘液和多糖/粘附素(PS/A),并在高粘附的生物膜中生長。轉座子突變體M187sn3不能產生生物膜和PS/A,但易于產生其他粘液相關抗原,因此,選擇它來研究SAL對細胞表面抗原和進入培養上清液的抗原的影響。

          制備化學限定培養基(CDM),加入不同濃度的SAL或乙二胺四乙酸(EDTA,二價陽離子螯合劑),從表皮葡萄球菌集落形成單位的數目確定SAL或EDTA對其生長的影響。用分光光度法對添加或未添加SAL、EDTA的CDM中生成的生物膜及培養板中的陽離子含量進行定量。

          培養細菌生長24小時,在存在或不存在SAL的條件下制備與粘液相關的抗原,用ELISA法測定抗原產量。劑量-反應曲線的線性回歸分析用于計算抗原效價。比較在SAL存在或不存在的情況下抗原滴度的變化,結果用抗原產生的抑制率表示,并用以下公式得到:抑制率(%)=100?[10(SAL中的ELISA滴度/不含SAL的平均ELISA滴度)]。

          結果:SAL的抑制作用,并非主要由于陽離子的螯合

          用螯合樹脂預處理CDM以去除CDM中的二價陽離子,可使91菌株的細菌生長減少88%,生物膜產量減少82%(P<0.001)。當陽離子Ca++、Fe++、Mn++和Mg++恢復到未經處理的CDM中的濃度時,細菌生長和生物膜產量也恢復到與未經處理的CDM中相當的水平(P<0.5)。

          CDM中含有SAL,可使細菌生長減少54%,生物膜產量減少55%。與用螯合的CDM獲得的結果相反,在含有SAL的CDM中補充這四個陽離子或這些陽離子的2至4倍劑量都不能恢復細菌的生長或生物膜產量(P<0.3)。

          圖1的結果表明,SAL對細菌生長和生物膜的抑制作用并非主要由于陽離子的螯合。圖1A所示,盡管在細菌生長過程中持續存在EDTA,但Mg++和Ca++的補充使其生長和生物膜產量以劑量相關的方式恢復到未經處理的CDM中的水平。相反,陽離子的補充不能克服SAL對生物膜產生的抑制作用,且陽離子的補充也不能將細菌生長恢復到未經處理的CDM中觀察到的水平(圖1B)。

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          圖1 SAL、EDTA對表皮葡萄球菌的生長和生物膜的抑制作用及補充陽離子后的反應

          A:含EDTA的CDM中,Mg++和Ca++的補充能恢復生物膜的產生;B:Mg++和Ca++的補充不能恢復SAL對生物膜的抑制作用

          SAL的作用歸因于粘液相關成分的生成受到抑制

          ELISA檢測從細胞體中提取的抗原表明,SAL使細菌中的磷壁酸(61%-95%)、粘液相關蛋白(63%-81%)和1型抗原(69%-95%)表達受損。但是,PS/A的產量僅受到22%-61%的抑制。與細胞提取物一樣,釋放到培養上清液中的磷壁酸、蛋白質和1型抗原的數量也隨之減少。對于產生強生物膜的菌株91,釋放到培養基中的那些抗原的量顯著減少,盡管細胞提取的抗原的量沒有像所測試的其他菌株那樣顯著地降低。當91菌株在7mM SAL中生長時,PS/A的產生被抑制了60%,細胞中提取的其他抗原被抑制超過了85%。

          SAL對善于產生PS/A的菌株M187sp11及其同源基因缺乏PS/A的突變株M187sn3的生長和抗原產生的抑制作用相似。M187sn3似乎與野生型不同之處僅在于其由于轉座子插入而導致PS/A無法產生,這大概是導致無法將粘液的其他各種成分組裝到生物膜中的原因。因此,SAL對這類菌株的等效抑制作用證實,SAL的主要作用是減少了幾種生物膜成分的產生,而不是減少這些成分在組裝成生物膜前在粘液層中的停留。

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