一.材料及主要試劑

（一）細胞系

人角質形成細胞（HKC）株,購自美國 Cascade Biologics 公司。

（二）主要試劑及藥品

1.M154 培養基（美國  Cascade Biologics 公司）

2.標準胎牛血清（天津 TBD 生物公司）

3.0.25%胰酶（美國Invitrogen 公司）

4.溴化四甲基偶氮唑藍（MTT）（美國 Sigma 公司）

5.二甲基椏楓（DMSO）（美國 Amresco 公司）

6.水楊酸（香港澳美制藥廠）

7.人激肽釋放酶 7（KLK7）ELISA 試劑盒（美國cusabio 技術公司） 

8.兔抗人 FLG 抗體（美國 Santa Cruz 公司）

9.SP 免疫組化染色試劑盒（北京中衫金橋生物公司）

10.DAB 酶底物顯色試劑盒（北京中衫金橋生物公司）

11.Isoplus 總 RNA 提取液（大連 TaKara 寶生物工程有限公司）

12.逆轉錄-聚合酶鏈反應 RT-PCR 試劑盒（大連 TaKara 寶生物工程有限公司）

13.引物合成（大連takara  寶生物工程有限公司）

14.DNA maker（DL5000）（大連 takara  寶生物工程有限公司）

15.6×loading buffer（大連 takara 寶生物工程有限公司）

16.瓊脂糖（大連 takara 寶生物工程有限公司）

17.溴化乙錠（EB）（  美國Amresco 公司）

18.DEPC 水（大連 takara寶生物工程有限公司）

19.無水乙醇  氯仿  異丙醇

二.主要的儀器設備

1.CO2 細胞孵育箱（美國 Forma Sicentific 公司）

2.超凈工作臺（  蘇州 SW-CJ-2FD）

3.低速離心機（北京醫用離心機廠，LDZ5-2）

4.倒置顯微鏡（日本 Olympus）

5.普通光學顯微鏡（重慶 COIC 光學儀器廠）

6.微量移液器（上海精科實業有限公司）

7.全自動酶標讀數儀（美國BIO-RAD2550）

8.ΜVP(CA91786)凝膠成像分析系統（美國 GENE 公司） 

9.高速低溫離心機（  德國 Eppendorf 公司）

10.PCR 擴增儀（TAKARA 寶生物工程有限公司）

11.超低溫冰箱（DF-1880，Forma，America）

三.實驗方法

（一）細胞的培養

（二）MTT 法檢測水楊酸對 HKC 細胞生存率的影響

（三）S-P 免疫組化方法檢測水楊酸對人角質形成細胞中 FLG 表達的影響

（二）（四）ELISA 方法檢測水楊酸對人角質形成細胞中 KLK7 表達的影響

（五）RT-PCR 方法檢測水楊酸對人角質形成細胞 KLK7  m RNA 和 FLG m RNA 表達的影響

結果

一.水楊酸對 HKC 生存率的影響

不同濃度水楊酸作用于人角質形成細胞 24h，MTT 法檢測細胞存活率（表 1 和圖1）。2000μg/ml，1000μg/ml 的水楊酸濃度作用人角質形成細胞24h的存活率分別為28.37%和71.16%，與陰性對照組（100%）相比明顯降低（P

二.水楊酸對人角質形成細胞中 FLG 蛋白表達的影響

0.5-500μg/ml水楊酸作用于人角質形成細胞24h后，免疫組化法檢測FLG的表達。500μg/ml,50μg/ml,5μg/ml,0.5μg/ml水楊酸組FLG的表達（1520.476±37.807，3627.906±228.503,1590.677±166.396,808.073±154.108）均明顯高于陰性對照組（563.067±70.144），P<0.01，其中水楊酸濃度為 50μg/ml 時的作用效果最明顯(見圖 2 和圖 3)。

圖2水楊酸對人角質形成細胞中FLG表達的影響 A:空白組(PBS代替一抗)B:陰性對照組;C:500μg/ml的水楊酸組；D:50μg/ml 的水楊酸組;E:5μg/ml 的水楊酸組;F:0.5μg/ml 的水楊酸組.四種濃度的水楊酸均可增加人角質形成細胞中FLG的表達水平，其中濃度為50μg/ml的水楊酸促進FLG表達的作用最明顯。 

三.水楊酸對人角質形成細胞中 KLK7蛋白表達的影響

KLK7 標準品按不同濃度（40ng/ml，20ng/ml，10ng/ml，5ng/ml，2.5 ng/ml，1.25ng/ml，0.62ng/ml）稀釋后的標準曲線見圖 4。0.5-500ug/ml 水楊酸作用于人角質 形 成 細 胞 24h 后 ， ELISA 法 檢 測KLK7 的 蛋 白 表 達 。與 陰 性 對 照 組（0.2325±0.1516）相比，水楊酸濃度在 500μg/ml,50μg/ml,5μg/ml,0.5μg/ml 時均能抑制人角質形成細胞中 KLK7  蛋白的表達（0.1017±0.01830,0.0787±0.01180, 0.9570±0.19140,0.1120±0.02120，P<0.01），其中 50μg/ml 的水楊酸對人角質形成細胞中 KLK7 表達的抑制作用最明顯（見圖 5）。

圖 5.水楊酸對 HKC 細胞中 KLK7 表達的影響, 與不加藥陰性對照相比，“**”表示P<0.01。四種濃度的水楊酸均可抑制人角質形成細胞中 KLK7 的表達水平，其中濃度為 50μg/ml 的水楊酸抑制 KLK7 表達的作用最明顯。

四.水楊酸對人角質形成細胞中 KLK7mRNA 的表達的影響

0.5-500ug/ml水楊酸作用于人角質形成細胞24h后，RT-PCR方法檢測KLK7mRNA的表達。與陰性對照組（10570±800.733）相比，濃度為500μg/ml、50μg/ml、5μg/ml、0.5μg/ml的水楊酸對人角質形成細胞中KLK7的表達均有抑制作用（分別為9556±512.000,7186±183.567,7571±235.119,8421±211.028 ） , 差 異 有 統 計 學 意 義（P<0.01）。其中水楊酸濃度為 50μg/ml 時對人角質形成細胞中 KLK7mRNA 的表達抑制作用最明顯（見圖 6 和圖 7）。

五．水楊酸對人角質形成細胞中 FLG mRNA 的表達的影響

0.5-500ug/ml 水楊酸作用于人角質形成細胞 24h 后，RT-PCR 方法檢測KLK7 m RNA 的表達。與陰性對照組（7760±74.746）相比，濃度為 500μg/ml,  50μg/ml,5μg/ml,0.5μg/ml 的水楊酸對人角質形成細胞中 FLG  的 m RNA 表達均有促進作用（ 13500±1014.193,16308±2034.382,137770 ± 2255.839,11935 ±505.433 ，P<0.01），其中水楊酸濃度為50μg/ml 時對人角質形成細胞中 FLG mRNA 的表達促進作用最明顯（見圖 8 和圖 9）。

結論

1、本實驗通過 ELISA 和 RT-PCR 的方法檢測發現，濃度為 0.5μg/ml-500μg/ml的水楊酸可以促進體外培養人角質形成細胞中 FLG 的蛋白和 m RNA 表達，并且抑制 KLK7 的蛋白和 m RNA 表達水平。其中，水楊酸濃度在 50μg/ml 時作用效果最明顯。

2、水楊酸可通過上調 FLG 和下調 KLK7 的表達水平，而改善表皮屏障功能，通過這些途徑，可能緩解特應性皮炎患者的皮膚脫屑情況，從而恢復皮膚屏障功能，為水楊酸用于特應性皮炎的治療提供實驗依據。